Productes
Kit de detecció Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per al 2019-nCoV
Ús previst
Aquest kit s'utilitza per a la detecció qualitativa del nou coronavirus (2019-nCoV) mitjançant hisops de gola, hisops nasofaringis, líquid de rentat broncoalveolar i esputs. El resultat de la detecció d'aquest producte és només per a referència clínica i no s'ha d'utilitzar com a única evidència per al diagnòstic i tractament clínic. Es recomana una anàlisi exhaustiva de la condició en combinació amb les manifestacions clíniques del pacient i altres proves de laboratori.
Principi d'inspecció
El kit es basa en la tecnologia RT-PCR d'un sol pas. De fet, els gens ORF1ab i N del nou coronavirus del 2019 (2019-nCoV) es van seleccionar com a regions diana d'amplificació. Es dissenyen encebadors específics i sondes fluorescents (les sondes del gen N estan marcades amb FAM i les sondes ORF1ab estan marcades amb HEX) per detectar l'ARN del nou tipus de coronavirus del 2019 en mostres. El kit també inclou un sistema de detecció de control intern endogen (sonda gènica de control intern marcada amb CY5) per monitoritzar el procés de recollida de mostres, l'ARN i l'amplificació de la PCR, reduint així els resultats falsos negatius.
components principals
| components | Volum(48T/Kit） |
| Solució de reacció RT-PCR | 96 µl |
| Mescla de sonda TaqMan del primer nCOV (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864 µl |
| Control negatiu | 1500 µl |
| Control positiu nCOV (l ORF1ab N Gen) | 1500 µl |
Reactius propis: reactius d'extracció o purificació d'ARN. Control negatiu/positiu: el control positiu és l'ARN que conté el fragment diana, mentre que el control negatiu és aigua sense àcids nucleics. Durant el seu ús, han de participar en l'extracció i s'han de considerar infecciosos. S'han de manipular i eliminar d'acord amb la normativa pertinent.
El gen de referència intern és el gen RnaseP humà.
Condicions d'emmagatzematge i data de caducitat
-20 ± 5 ℃, eviteu la congelació i descongelació repetides més de 5 vegades, vàlid durant 6 mesos.
Instrument aplicable
Amb FAM / HEX / CY5 i altres instruments de PCR fluorescents multicanal.
Requisits de la mostra
1. Tipus de mostres aplicables: hisops de gola, hisops nasofaringis, líquid de rentat broncoalveolar, esput.
2. Recollida de mostres (tècnica asèptica)
Hisop faríngi: Netegeu les amigdales i la paret faríngia posterior amb dos hisops alhora i, a continuació, submergiu el cap de l'hisop en un tub d'assaig que conté la solució de mostreig.
Esput: Després que el pacient tossi profundament, recolliu l'esput tossit en un tub d'assaig amb tap de rosca que contingui la solució de mostreig; líquid de rentat broncoalveolar: mostreig per professionals mèdics. 3. Emmagatzematge i transport de mostres
Les mostres per a l'aïllament del virus i les proves d'ARN s'han de provar tan aviat com sigui possible. Les mostres que es poden detectar en 24 hores es poden emmagatzemar a 4 ℃; les que no es poden detectar en 24
hores s'han d'emmagatzemar a -70 ℃ o per sota (si no hi ha cap condició d'emmagatzematge de -70 ℃, s'han de
emmagatzemat temporalment a -20 ℃ (nevera). Cal evitar la congelació i descongelació repetides de les mostres durant el transport. Les mostres s'han d'enviar al laboratori tan aviat com sigui possible després de la recollida. Si cal transportar les mostres a llargues distàncies, es recomana l'emmagatzematge en gel sec.
Mètodes de prova
1 Processament de mostres i extracció d'ARN (àrea de processament de mostres)
Es recomana prendre 200 μl de mostra líquida per a l'extracció d'ARN. Per als passos d'extracció relacionats, consulteu les instruccions dels kits d'extracció d'ARN comercials. Tant la mostra negativa com la negativa
Els controls d'aquest kit van participar en l'extracció.
2 Preparació de reactius de PCR (àrea de preparació de reactius)
2.1 Traieu tots els components del kit i descongeleu-los i barregeu-los a temperatura ambient. Centrifugueu a 8.000 rpm durant uns segons abans d'utilitzar-los; calculeu la quantitat necessària de reactius i prepareu el sistema de reacció tal com es mostra a la taula següent:
| components | Ració N (sistema de 25 µl) |
| Mescla de sonda TaqMan imprimació nCOV | 18 µl × N |
| Solució de reacció RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = nombre de mostres analitzades + 1 (control negatiu) + 1 (nCOV)control positiu) | |
2.2 Després de barrejar bé els components, centrifugueu durant un curt període de temps per deixar que tot el líquid de la paret del tub caigui al fons del tub i, a continuació, alíquoteu els 20 µl del sistema d'amplificació al tub de PCR.
3 Mostreig (zona de preparació de mostres)
Afegiu 5 μl dels controls negatiu i positiu després de l'extracció. L'ARN de la mostra que s'ha d'analitzar s'afegeix al tub de reacció de PCR.
Tanqueu bé el tub i centrifugueu-lo a 8.000 rpm durant uns segons abans de transferir-lo a la zona de detecció d'amplificació.
4 Amplificació per PCR (àrea de detecció amplificada)
4.1 Col·loqueu el tub de reacció a la cel·la de mostra de l'instrument i configureu els paràmetres de la manera següent:
| escenari | Cicle número | Temperatura(°C) | Temps | col·lecciólloc |
| Inverstranscripció | 1 | 42 | 10 minuts | - |
| Predesnaturalitzación | 1 | 95 | 1 minut | - |
| Cicle | 45 | 95 | 15 segons | - |
| 60 | anys 30 | recollida de dades |
Selecció del canal de detecció de l'instrument: seleccioneu el canal FAM, HEX, CY5 per al senyal de fluorescència. Per a la fluorescència de referència NONE, no trieu ROX.
5 Anàlisi de resultats (consulteu les instruccions experimentals de cada instrument per a la configuració)
Després de la reacció, deseu els resultats. Després de l'anàlisi, ajusteu el valor inicial, el valor final i el valor llindar de la línia base segons la imatge (l'usuari pot ajustar segons la situació real, el valor inicial es pot establir a 3~15, el valor final es pot establir a 5~20, ajust) al gràfic logarítmic. Al llindar de la finestra, la línia llindar es troba en la fase logarítmica i la corba d'amplificació del control negatiu és una línia recta o per sota de la línia llindar).
6 Control de qualitat (s'inclou un control procedimental a la prova). Control negatiu: no hi ha una corba d'amplificació òbvia per als canals de detecció FAM, HEX i CY5.
Control positiu de COV: corba d'amplificació òbvia dels canals de detecció FAM i HEX, valor Ct ≤ 32, però sense corba d'amplificació del canal CY5;
Els requisits anteriors s'han de complir simultàniament en el mateix experiment; en cas contrari, l'experiment no és vàlid i s'ha de repetir.
7 Determinació dels resultats.
7.1 Si no hi ha cap corba d'amplificació o un valor Ct > 40 als canals FAM i HEX de la mostra de prova, i hi ha una corba d'amplificació al canal CY5, es pot jutjar que no hi ha ARN del nou coronavirus 2019 (2019-nCoV) a la mostra;
.2 Si la mostra de prova té corbes d'amplificació òbvies als canals FAM i HEX, i el valor Ct és ≤40, es pot jutjar que la mostra és positiva per al nou coronavirus del 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si la mostra de prova té una corba d'amplificació clara només en un canal de FAM o HEX, i el valor Ct és ≤40, i no hi ha cap corba d'amplificació a l'altre canal, cal tornar a provar els resultats. Si els resultats de la nova prova són consistents, es pot considerar que la mostra és positiva per al nou
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Si el resultat de la nova prova és negatiu, es pot jutjar que la mostra és negativa per al nou coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valor del judici positiu
El mètode de la corba ROC s'utilitza per determinar el valor de referència del CT del kit i el valor de referència del control intern és 40.
Interpretació dels resultats de les proves
1. Cada experiment s'ha de provar per a controls negatius i positius. Els resultats de les proves només es poden determinar quan els controls compleixen els requisits de control de qualitat.
2. Quan els canals de detecció FAM i HEX són positius, el resultat del canal CY5 (canal de control intern) pot ser negatiu a causa de la competència del sistema.
3. Quan el resultat del control intern és negatiu, si els canals de detecció FAM i HEX del tub d'assaig també són negatius, significa que el sistema està desactivat o que el funcionament és incorrecte i que la prova no és vàlida. Per tant, cal tornar a analitzar les mostres.
