Productes
Kit de detecció Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per a 2019-nCoV
Ús esperat
Aquest kit s'utilitza per a la detecció qualitativa del nou coronavirus (2019-nCoV) mitjançant hisopos de gola, hisops nasofaríngies, líquid de rentat broncoalveolar, esputo. El resultat de la detecció d'aquest producte és només per a referència clínica i no s'ha d'utilitzar com a únic. evidència per al diagnòstic i tractament clínics. Es recomana una anàlisi exhaustiva de la malaltia en combinació amb les manifestacions clíniques del pacient i altres proves de laboratori.
Principi d'inspecció
El kit es basa en la tecnologia RT-PCR d'un sol pas.De fet, els gens ORF1ab i N del nou coronavirus (2019-nCoV) del 2019 es van seleccionar com a regions objectiu d'amplificació.Els cebadors específics i les sondes fluorescents (les sondes del gen N estan marcades amb FAM i les sondes ORF1ab estan marcades amb HEX) estan dissenyades per detectar ARN de coronavirus de nou tipus 2019 a les mostres.El kit també inclou un sistema de detecció de control intern endogen (sonda gènica de control interna etiquetada amb CY5) per controlar el procés de recollida de mostres, amplificació d'ARN i PCR, reduint així els falsos negatius.
Components principals
| Components | Volum（48T/Kit） |
| Solució de reacció RT-PCR | 96 µl |
| Barreja de sonda TaqMan del primer nCOV (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864 µl |
| Control negatiu | 1500µl |
| Control positiu nCOV (l ORF1ab N Gen) | 1500µl |
Reactius propis: reactius d'extracció o purificació d'ARN.Control negatiu/positiu: el control positiu és l'ARN que conté el fragment diana, mentre que el control negatiu és aigua lliure d'àcid nucleic.Durant l'ús, han de participar en l'extracció i s'han de considerar infeccioses.S'han de manipular i eliminar d'acord amb la normativa vigent.
El gen de referència interna és el gen RnaseP humà.
Condicions d'emmagatzematge i data de caducitat
-20 ± 5 ℃, eviteu la congelació i descongelació repetida més de 5 vegades, vàlid durant 6 mesos.
Instrument aplicable
Amb FAM / HEX / CY5 i un altre instrument de PCR fluorescent multicanal.
Requisits de la mostra
1.Tipus d'exemplars aplicables: hisops de gola, hisops nasofaríngs, líquid de rentat broncoalveolar, esputo.
2. Recollida de mostres (tècnica asèptica)
Esponja faríngia: netegeu les amígdales i la paret faríngia posterior amb dos hisopos alhora i, a continuació, submergiu el capçal del hisop en un tub d'assaig que conté la solució de mostreig.
Esput: després que el pacient tingui una tos profunda, recolliu l'esput amb tos en un tub d'assaig amb tap de rosca que conté la solució de mostreig;Líquid de rentat broncoalveolar: mostreig per professionals mèdics.3. Emmagatzematge i transport de mostres
Les mostres per a l'aïllament del virus i les proves d'ARN s'han de provar tan aviat com sigui possible.Les mostres que es poden detectar en 24 hores es poden emmagatzemar a 4 ℃;aquells que no es poden detectar en 24
Les hores s'han d'emmagatzemar a -70 ℃ o menys (si no hi ha una condició d'emmagatzematge de -70 ℃, haurien de ser
emmagatzemat temporalment a -20 ℃ a la nevera).Les mostres han d'evitar la congelació i descongelació repetida durant el transport.Les mostres s'han d'enviar al laboratori tan aviat com sigui possible després de la recollida.Si les mostres s'han de transportar a llargues distàncies, es recomana emmagatzemar gel sec.
Mètodes de prova
1 Processament de mostres i extracció d'ARN (àrea de processament de mostres)
Es recomana prendre 200 μl de mostra líquida per a l'extracció d'ARN.Per als passos d'extracció relacionats, consulteu les instruccions dels kits d'extracció d'ARN comercials.Tant el negatiu com el negatiu
els controls d'aquest kit van participar en l'extracció.
2 Preparació de reactius de PCR (àrea de preparació de reactius)
2.1 Traieu tots els components del kit i descongeleu-los i barregeu-los a temperatura ambient.Centrifugar a 8.000 rpm durant uns segons abans de fer servir;calculeu la quantitat necessària de reactius i el sistema de reacció es prepara tal com es mostra a la taula següent:
| Components | Ració N (sistema de 25 µl) |
| Mescla de sonda TaqMan imprimació nCOV | 18 µl × N |
| Solució de reacció RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = nombre de mostres provades + 1 (control negatiu) + 1 (nCOVcontrol positiu) | |
2.2 Després de barrejar bé els components, centrifugueu durant un temps curt per deixar que tot el líquid de la paret del tub caigui a la part inferior del tub, i després aliquote el sistema d'amplificació de 20 µl al tub de PCR.
3 Mostra (àrea de preparació de mostres)
Afegiu 5 μl dels controls negatius i positius després de l'extracció.L'ARN de la mostra a provar s'afegeix al tub de reacció de PCR.
Tapeu el tub amb força i centrifugueu a 8.000 rpm durant uns segons abans de transferir-lo a l'àrea de detecció d'amplificació.
4 Amplificació per PCR (àrea de detecció amplificada)
4.1 Col·loqueu el tub de reacció a la cel·la de mostra de l'instrument i configureu els paràmetres de la següent manera:
| etapa | Cicle nombre | Temperatura(°C) | Temps | col · lecciólloc |
| Revéstranscripció | 1 | 42 | 10 min | - |
| Pre-desnaturalitzación | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cicle | 45 | 95 | 15 segons | - |
| 60 | anys 30 | recopilació de dades |
Selecció del canal de detecció d'instruments: seleccioneu el canal FAM、HEX、CY5 per al senyal de fluorescència.Per a fluorescents de referència CAP, si us plau, no trieu ROX.
5 Anàlisi de resultats (consulteu les instruccions experimentals de cada instrument per a la configuració)
Després de la reacció, deseu els resultats.Després de l'anàlisi, ajusteu el valor inicial, el valor final i el valor llindar de la línia base segons la imatge (l'usuari pot ajustar-se segons la situació real, el valor inicial es pot establir entre 3 i 15, el valor final es pot establir en 5~20, ajust) al gràfic logarítmic Al llindar de la finestra, la línia de llindar es troba en fase logarítmica i la corba d'amplificació del control negatiu és una línia recta o per sota de la línia de llindar).
6 Control de qualitat (un control de procediment s'inclou a la prova) Control negatiu: no hi ha corba d'amplificació òbvia per als canals de detecció FAM, HEX, CY5 n
Control positiu COV: corba d'amplificació òbvia dels canals de detecció FAM i HEX, valor Ct ≤32, però sense corba d'amplificació del canal CY5;
Els requisits anteriors s'han de complir simultàniament en el mateix experiment;en cas contrari, l'experiment no és vàlid i s'ha de repetir.
7 Determinació de resultats.
7.1 Si no hi ha corba d'amplificació o valor Ct> 40 als canals FAM i HEX de la mostra de prova, i hi ha una corba d'amplificació al canal CY5, es pot jutjar que no hi ha nou coronavirus 2019 (2019-nCoV) ARN a la mostra;
.2 Si la mostra de prova té corbes d'amplificació òbvies als canals FAM i HEX, i el valor Ct és ≤40, es pot jutjar que la mostra és positiva per al nou coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si la mostra de prova només té una corba d'amplificació clara en un canal de FAM o HEX, i el valor Ct és ≤40 i no hi ha cap corba d'amplificació a l'altre canal, els resultats s'han de tornar a provar.Si els resultats de la nova prova són consistents, es pot considerar que la mostra és positiva per a la nova
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Si el resultat del nou test és negatiu, es pot jutjar que la mostra és negativa per al nou coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valor de judici positiu
El mètode de la corba ROC s'utilitza per determinar el valor CT de referència del kit i el valor de referència de control intern és 40.
Interpretació dels resultats de les proves
1.Cada experiment s'ha de provar per a controls negatius i positius.Els resultats de les proves només es poden determinar quan els controls compleixen els requisits de control de qualitat
2. Quan els canals de detecció FAM i HEX són positius, el resultat del canal CY5 (canal de control intern) pot ser negatiu a causa de la competència del sistema.
3. Quan el resultat del control intern és negatiu, si els canals de detecció FAM i HEX del tub d'assaig també són negatius, vol dir que el sistema està desactivat o que el funcionament és incorrecte, la prova no és vàlida.Per tant, les mostres s'han de tornar a provar.
